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輝駿生物慢病毒包裝技術答疑

1、  慢病毒載體系統包括了哪些質粒?
現在通常所用的慢病毒載體系統由4質粒組成,包括1個慢病毒表達質粒和3個包裝質粒。其中,慢病毒表達質粒攜帶慢病毒必需的HIV-1長末端重復序列(LTRs)、包裝信號(Ψ)以及能促進外源基因表達、病毒滴度和病毒整體功能的其它元件(WPRE、cPPT/CTS和RRE);3個包裝質粒分別表達產生慢病毒包裝必需的蛋白——Gag/Pol、Rev和VSV-G。

2、慢病毒的包裝容量有多大?
慢病毒的包裝容量約為10~10.5 Kb左右。去除約3 Kb的病毒骨架元件(LTRs、Ψ等),慢病毒載體的基因裝載量約為7.0~7.5 Kb。由于啟動子等調控元件、篩選所需的抗性基因/熒光基因仍需占據一定空間,所以慢病毒可容納的外源基因片段不得超過4kb,否則將無法包裝出慢病毒;并且外源基因越長,越難獲得高滴度的病毒液(通常插入的片段在3kb以內)。

3、慢病毒對目的細胞的感染效率很低,如何提高病毒的感染效率?
首先要保證細胞在感染之前處于良好的生長狀態,提前24小時在細胞板上鋪好細胞。其次可以使用易感細胞如293T進行滴度測試,檢測慢病毒濃縮液滴度是否出現大幅下降。在此基礎上適當提高慢病毒感染的MOI值和延長感染時間。另外,還可以選擇在培養基中添加polybrene或更換為Fitransfer培養基。

4、加入慢病毒后,目的細胞狀態很差或出現大量死亡,原因是什么?如何解決?
慢病毒感染宿主細胞時可能引發細胞的毒性反應,如果所選擇的宿主細胞對慢病毒感染很敏感,則會出現嚴重的生理異;蛩劳。針對這種情況有以下幾點解決方法:首先要在感染之前保證細胞處于良好的生長狀態;二是要適當減少病毒用量,以降低細胞的毒性反應;三是要根據細胞反應,在感染后4~12h為細胞換液,并觀察細胞的反應。

6、如何確定選擇的宿主細胞能否被慢病毒感染?
在正式實驗之前需要進行慢病毒感染預實驗,即用空的帶熒光標記的慢病毒來感染選定的宿主細胞,根據細胞是否可觀察到熒光,來判斷慢病毒對此靶細胞的親嗜性。

7、穩定細胞株篩選的藥物濃度如何確定?
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素篩選穩定細胞系細胞之前,需要先通過梯度實驗確定適合該類細胞的最佳藥物濃度。對于一些常見的細胞系,通?梢栽谖墨I等資料中找到推薦的藥物濃度。用G418或潮霉素B,選用在5天左右出現細胞大批死亡,2周全部死亡的濃度作為篩選濃度。對于嘌呤霉素,通常采用在3-4天殺死全部細胞的濃度。不同批次的藥物活性有一定差異。因此在使用新批次藥物時,需要重新測定最佳濃度。
 
 
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