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雙向電泳原理及操作步驟

實驗概要
本文介紹了雙向電泳原理及操作步驟(第一向等電聚焦和第二向SDS-PAGE電泳)。

實驗原理
二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術結合了等電聚焦技術(根據蛋白質等電點進行分離)以及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(根據蛋白質的大小進行分離)。這兩項技術結合形成的二維電泳是分離分析蛋白質最有效的一種電泳手段。
通常第一維電泳是等電聚焦,在細管中(φ1~3 mm)中加入含有兩性電解質、8M的脲以及非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進行等電聚焦,變性的蛋白質根據其等電點的不同進行分離。而后將凝膠從管中取出,用含有SDS的緩沖液處理30 min,使SDS與蛋白質充分結合。
將處理過的凝膠條放在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠上,加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定并與濃縮膠連接。在第二維電泳過程中,結合 SDS的蛋白質從等電聚焦凝膠中進入SDS-聚丙烯酰胺凝膠,在濃縮膠中被濃縮,在分離膠中依據其分子量大小被分離。
這樣各個蛋白質根據等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。細胞提取液的二維電泳可以分辨出1000~2000個蛋白質,有些報道可以分辨出5000~10000個斑點,這與細胞中可能存在的蛋白質數量接近。由于二維電泳具有很高的分辨率,它可以直接從細胞提取液中檢測某個蛋白。

實驗步驟
1. 第一向等電聚焦
   1) 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室溫溶解。
   2) 在小管中加入0.01g DTT,Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml,充分混勻。
   3) 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液,加入100ml樣品,充分混勻。
   4) 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預制膠條(17cm pH 4-7),室溫中放置10分鐘。
   5) 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣,中間的樣品液一定要連貫。注意:不要產生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質的分布。
   6) 當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤或水化盤中后,用鑷子輕輕的去除預制IPG膠條上的保護層。
   7) 分清膠條的正負極,輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上,使得膠條的正極(標有 )對應于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上,因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產生氣泡。如果已經產生氣泡,用鑷子輕輕地提起膠條的一端,上下移動膠條,直到氣泡被趕到膠條以外。
   8) 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油,防止膠條水化過程中液體的蒸發。需緩慢的加入礦物油,沿著膠條,使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。
   9) 對好正、負極,蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。
   10) 聚焦結束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳,否則將膠條置于樣品水化盤中,-20℃冰箱保存。
2. 第二向SDS-PAGE電泳
  1) 配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液,每塊凝膠40ml,將溶液分別注入玻璃板夾層中,上部留1cm的空間,用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封面,保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后,表明凝膠已基本聚合。
   2) 待凝膠凝固后,倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇,用MilliQ水沖洗。
   3) 從-20℃冰箱中取出的膠條,先于室溫放置10分鐘,使其溶解。
   4) 配制膠條平衡緩沖液I。
   5) 在桌上先放置干的厚濾紙,聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕,擠去多余水分,然后直接置于膠條上,輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。
   6) 將膠條轉移至溶漲盤中,每個槽一根膠條,在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
   7) 配制膠條平衡緩沖液II。
   8) 第一次平衡結束后,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液(將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表面)。再加入膠條平衡緩沖液II,繼續在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
   9) 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上,長玻璃板在下,短玻璃板朝上。
   10) 將瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。
   11) 將10×電泳緩沖液,用量筒稀釋10倍,成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。
   12) 第二次平衡結束后,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液(將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表面)。
   13) 將IPG膠條從樣品水化盤中移出,用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其余膠條同樣操作。
   14) 將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上,短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。
   15) 用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭,輕輕地將膠條向下推,使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時,要注意是推動凝膠背面的支撐膜,不要碰到膠面。
   16) 放置5分鐘,使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。
   17) 在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉移至電泳槽中。
   18) 在電泳槽加入電泳緩沖液后,接通電源,起始時用的低電流(5mA/gel/17cm)或低電壓,待樣品在完全走出IPG膠條,濃縮成一條線后,再加大電流(或電壓)(20-30mA/gel/17cm),待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。
   19) 電泳結束后,輕輕撬開兩層玻璃,取出凝膠,并切角以作記號(戴手套,防止污染膠面)。
   20) 進行染色。




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