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iTRAQ常見10大問題及答疑

1、iTRAQ與其他蛋白質組學技術有何不同,我們該如何選擇?

雙向電泳是最早、最經典的蛋白質組技術,適用于大部分樣本,只是對強酸或強堿性蛋白,以及分子量太大或太小的蛋白質分離效果不好;另外由于各個樣本需要單獨跑膠,很難避免操作誤差對結果的影響,可能導致定量不準確;但是雙向電泳的服務價格相對便宜,可以用于樣本差異的初步篩選;

DIGE在雙向電泳基礎上做了改進,引入了熒光標記物和內標,可以使定量更加準確;但該技術也是依據蛋白的等電點和分子量分離,因此對強酸或強堿性蛋白,以及分子量太大或太小的蛋白質分離效果也不好。

iTRAQ、TMT、label-freeSILAC都是利用液質聯用技術來尋找差異蛋白。其中,iTRAQ和TMT的原理和檢測方法基本一致,只是使用了不同的標記物;TMT有10種標記物,可對多達10種不同樣本進行分析,但是由于其標記物的質量數非常相近,因此必須使用超高分辨率的質譜(Thermo公司的QE質譜儀)才可以滿足檢測,這也必然會導致信號干擾更多,可能會影響定量的準確性;label-free是非標記的蛋白質組學技術,由于沒有標記物,其定量需要依賴于操作和質譜儀的穩定性,該技術鑒定到的蛋白數目會少于iTRAQ技術,并且定量的準確性較差,優勢是服務費用較低;SILAC是基于穩定同位素標記的細胞培養技術的蛋白質組學方法,利用不同的同位素培養基來培養不同組別的細胞,達到體內標記的目的,其定量準確性要比其他蛋白質組學技術更高;但是由于缺乏合適的同位素培養基,該方法基本只能用于可傳代的哺乳動物細胞系。
從定量準確性、應用性等各方面綜合考慮, iTRAQ技術已成為近年來利用最廣泛的蛋白質組學技術。


2、iTRAQ實驗對樣本有何要求?

任何類型的樣本都可以,如果是罕見物種,可以用近緣物種的數據庫檢索,也可提供轉錄組數據庫來檢索;一次上機,每組樣本需要用200ug蛋白,但由于需要蛋白定量檢測和預實驗,因此每組樣本所需的蛋白量大概在500ug左右;我公司負責蛋白質的提取,客戶只需要提供足夠的原始樣本。


3、不同類型的樣本做iTRAQ可否一次上機?

不能。如果樣品來源于不同物種,檢索時就無法選擇數據庫,也就無法分析數據;即使是同一物種的樣本,它們的蛋白種類和豐度也可能有很大差別(比如植物的根和葉),將這些酶切肽段混合上機,其數據會相互干擾,導致蛋白定性和定量的不準確。


4、iTRAQ實驗是否需要設置重復?

我們常說的重復包括生物學重復和技術重復,iTRAQ中常說到的還有上機重復;生物學重復即樣本重復,采集來源于同一組別的不同樣本(例如同樣處理的不同植物、同一疾病的不同患者血清等),通常設置3個生物學重復,但臨床樣本一般要求生物學重復更多(如疾病組和健康組各十幾例樣本);當生物學重復的樣本很多時,可以將同組樣本混合后再標記,便可以通過一次上機檢測;技術重復,通常是同一個樣本用不同標記物標記,這樣可以排除因蛋白提取、酶解、標記等操作引入的誤差;另外ITRAQ實驗有時會設計上機重復,這其實也屬于技術重復的范疇,即相同的樣本上兩次機,來排除操作誤差和儀器誤差。目前發SCI論文一般需要設置重復(無論何種重復),否則可能會被質疑數據的準確性;另外從數據質量上講,重復能更有效的幫助我們排除不可信蛋白,無論是對WB驗證還是后續研究,都是很有利的。


5、iTRAQ的重復性好不好?

我們通常所考慮的iTRAQ重復性指定量的重復性,即同樣的樣本在上機兩次時得到的結果是否一致;iTRAQ實驗重復性的好壞就決定了數據的準確性。一般來說,由于質譜選取肽段的隨機性,可能導致檢測到的肽段及其強度不同,在經過軟件匹配分析后,得到的蛋白比值可能會不一樣。一般得分和比值比較靠后的蛋白才會出現定量的嚴重偏差,而絕大部分蛋白的比值趨勢是一致的。因此在分析時,我們會將鑒定到的蛋白先按FDR(錯誤發現率)或unused值進行篩選,選取置信度大于95%(unused>1.3)或99%(unused>2)的蛋白作為可信蛋白,再進行分析。
 

6、我們的儀器定性和定量的準確性如何?

輝駿生物使用的是Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS System,該儀器將高性能四極桿的母離子選擇性與高分辨的準確質量數(HR/AM)Orbitrap檢測技術相結合,可顯著提高樣品的分析通量和數據質量:


> 超高分辨率(高達140,000 FWHM)——區分分子量差異的能力強;
> 質量精度優,使用全自動AGC和質量校準程序,在全掃描和全部離子碎裂(AIF)模式下質量精度優于1 ppm;
> 掃描速度快,快速掃描頻率達到12Hz,與UHPLC快速色譜技術聯用時可確保精確質量分析;在任何掃描模式下,快速極性切換無需犧牲質量精度;在35,000分辨率下,一個正離子和一個負離子掃描的完整周期分析僅需1秒;
> 質量范圍廣,擴展至50 - 6,000 m/z,可分析完整蛋白和單電荷離子;
> 全部離子碎裂(AIF)采用多重碎裂技術,離子源碰撞誘導解離(CID)和可選的高能量碰撞解離(HCD),使得MS和MS/MS數據能夠得到增強的結構信息;
> 四極桿質量數過濾器:高級四極桿技術(AQT)提高母離子選擇和傳輸能力,使復雜基質中低豐度分析物的定量更準確;
> 多重檢測能力提高單個周期的分析效率:精密的數據非依賴采集(DIA)和平行反應監測(PRM)用以實現更高置信度、更好重現性以及更高通量的定量分析結果;
> 新的S型離子光學,使靈敏度提高3倍;
> 高效軟件SIEVE 2.0可用于蛋白、肽段和代謝物的差異表達分析。

7、用不同標記物來標記生物學重復的樣本,如何計算差異比值和選擇差異蛋白?
例如有A和B兩個樣本,每個樣本2個重復;
A1 B1 A2 B2
114 115 116 117

A1/B1=114/115,A2/B2=115/116;

常用的有2種選擇差異蛋白的方法,一是根據114/115的值選出來一組差異蛋白,再根據115/116的值選出一組差異蛋白,找兩個結果的集合,這種方法是比較嚴格的篩選方法,得到的差異蛋白數據相對較少;二是將全部蛋白的2組比值做重復性分析,根據變異系數(±50%)選擇重復性較好的點,再計算2組數據的平均值,最后根據差異倍數、P值或者正態分布規律選取差異蛋白;我們現在通常選擇第二種方法。

8、按什么標準來選取差異蛋白?

差異蛋白的選取目前并沒有統一標準,有多種選擇方法,根據比值篩選,結合比值和標準差篩選,或根據T-Test篩選;我們目前一般根據比值進行選擇,即差異倍數≤0.67和≥1.5,有時也會按照p≤0.05的標準過濾。


9、iTRAQ實驗的數據采用不同數據庫檢索時,各組間的比值為何是不同的?

iTRAQ技術中不同標記物之間的比值與檢索數據庫、質譜電信號的噪音以及采集質譜時的隨機性都有關。所以在使用不同數據庫檢索時,由于匹配肽段情況的不同,定量結果也有些許差異,但是總體變化趨勢應是一致的。


10、檢索時為什么同一個編號對應了很多蛋白質?

因為一個蛋白家族中常常含有多個同源性很高的蛋白質,這些蛋白質被酶切之后,很可能會產生很多相同的肽段,軟件在進行定性分析時,就會將這些肽段均歸于得分最高的那種蛋白質,其他同源蛋白不計分,并且這些同源蛋白都采用同一編號。

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