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肺泡上皮細胞分離方法

肺泡上皮細胞(AECs)是肺細胞的主要類型之一,可用于分析肺上皮細胞對外界因素的反應。因此,小鼠肺部的AECs可以作為疾病的體外模型。AECs對于研究肺的發育、損傷和修復是必不可少的。從事呼吸系統疾病如急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、囊性纖維化、肺氣腫和肺炎研究的人員通常依賴AECs進行研究。

 

一、AECs需要特殊處理

第一次分離小鼠肺泡上皮細胞是很棘手的,肺上皮細胞周圍有大量的白細胞和內皮細胞需要分離。更復雜的是,AECs需要通過分散酶消化而從肺的細胞外基質中釋放出來。分散酶能特異性地裂解存在于AECs基底膜中的IV型膠原蛋白和纖連蛋白,需要通過氣管艱難地注入。

 

二、區分肺泡上皮細胞的類型

肺泡上皮細胞有兩種類型:I型肺泡上皮細胞(AECI)和II型肺泡上皮細胞(AECII)。

 

AECI很薄,是一種細長的鱗狀細胞,主要幫助肺泡和血液之間的氣體交換。AECII是一種小立方形的細胞,分泌肺表面活性物質以降低肺泡表面張力。由于AECII更豐富(大約占ACEs的60%),它們比AECI更容易分離。因此,大多數人從肺中分離出初生AECII細胞,然后對它們進行分化,以獲得AECI樣表型。

 

三、從小鼠肺中分離AECII細胞

分離肺泡上皮細胞最著名和廣泛遵循的protocol是由M. Corti和他的同事描述的, 為了達到高純度,不同的小組對原始協議進行了修改。如下分享一些小技巧,將幫助優化您的細胞分離方法,以獲得那些>90%的純細胞。

 

1、優化消化步驟

在肺提取步驟,優化肺組織在分散酶的孵育條件,因為它是肺組織成功消化的關鍵步驟,影響產量。經過嘗試,最終優化得到最適條件,37℃孵育20 min,在2ml分散酶中連續旋轉。

 

2、優化上皮細胞的分離

肺組織消化后,獲得單細胞懸液。為了從所需的上皮細胞中分離血細胞,使用Corti等人推薦的CD45和CD16/32抗體濃度。但Corti研究中提到的磁珠分離系統比較舊,嘗試使用Promega公司的鏈霉親和素包被的磁珠和相應的分離柱。這種磁珠分離裝置也可用于純化其他類型的細胞(如污染白細胞中的內皮細胞)。

 

3、優化上皮細胞的純化

根據Corti 的protocol, 磁性柱中CD45和CD16/32陰性群體(上皮細胞)可進一步純化,在培養皿中37℃培養4h -16h。很明顯,這種長時間的孵化需要優化。

 

細胞培養分別采用4h、8h和16h,并監測它們的純度。有趣的是,4小時后已經用流式細胞儀觀察到了>90%的純度。雖然較長的培養時間導致相同的純度,但由于上皮細胞附著在培養皿上,導致產量下降。
 

4、細胞純度的最后檢查

4小時后,細胞可以從培養皿的上清液中收集。使用Corti等人的協議,以及概述的優化步驟,獲得的AECII細胞應該是高純度的(大約90%),使用流式細胞術通過上皮細胞粘附分子(EpCAM)染色可進行檢測。然后,它們可在氣道上皮培養基中37℃下5% CO2進行培養。使用這種特殊培養基的優點是它支持生長而不需要添加FBS。含有FBS的培養基可以引起細胞的自發激活,在實驗室中是需要避免的。

 

這些高純度的AECII細胞可以直接用于實驗,也可以進行分化,分化為AECI,通過在5% CO2、37℃,在纖維連接蛋白包被的培養板上培養7天。

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