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蛋白質互作:串聯親和純化(TAP-MS)

技術簡介

蛋白質互作研究按照實驗目的可分為兩大類,一是驗證兩個蛋白是否存在相互作用,二是篩選某個興趣蛋白的互作蛋白。 目前,常用的蛋白質互作分析技術有:免疫共沉淀(CO-IP),pull-down、串聯親和純化法(tandem affinity purification,TAP)和基于SILAC技術的免疫共沉淀(SILAC-IP)等。
       
其中CO-IP、Pull-down常被用來驗證兩個蛋白的相互作用;雖然CO-IP或Pull-down結合質譜的方法也可用來篩選互作蛋白,但常常會帶來很多假陽性結果;因此,TAP和SILAC-IP技術在篩選互作蛋白的研究方面表現出了一定優勢。
       
串聯親和純化技術 (tandem affinity purification,TAP)與COIP技術篩選互作蛋白的原理類似。不同的是TAP技術使誘餌蛋白帶上了2個純化標簽,利用標簽對蛋白復合物進行了兩輪純化(串聯親和純化),使洗脫液中的非特異性蛋白降至較低水平。結合LC-MS/MS技術,分別鑒定出實驗組和陰性對照組洗脫液中的蛋白質種類,從而找到實驗組中獨有的蛋白質,即可能的互作蛋白。


應用領域


信號通路研究:尋找特定目標蛋白的互作蛋白。


技術流程


構建誘餌蛋白的雙標載體——包裝慢病毒——篩選穩轉株——提取總蛋白——串聯親和純化——洗脫液的蛋白酶解——LC-MS/MS——蛋白質定性和定量結果——篩選實驗組獨有蛋白

輝駿生物:串聯親和純化流程圖


技術優點


1. 捕獲到的是天然互作的蛋白,符合體內真實生理情況,可信度高。

2. 采用兩步純化,能有效減少假陽性率。


參考文獻


1.Proteomic Analysis of the Human Cyclin-dependent Kinase Family Reveals a Novel CDK5Complex Involved in Cell Growth and Migration.Mol Cell Proteomics. 13(11):2986-3000(2014).

2.Defining the protein-protein interaction network of the human protein tyrosine phosphatase

       
3.Family.Mol Cell Proteomics. 15(9):3030-44(2016).
       
4.Novel interacting proteins identified by tandem affinity purification coupled to nano LC-MS/MS interact with ribosomal S6 protein kinase 4 (RSK4) and its variant protein (RSK4m). Int J BiolMacromol. 96:421-428(2017).

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