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核酸蛋白互作:RNA/DNA pull down,CHIRP

技術簡介

核酸與蛋白互作不僅是生物有機體展示其生命活動的基本形式之一,還是核酸和蛋白功能闡釋的重要內容。常用于核酸與蛋白互作研究的技術包括:RNA pull down、DNA pull down、ChIRP、ChIP、reverse-ChIP、RIP等。

其中,RNA/DNA pull down是研究體外條件下RNA或DNA與蛋白互作的重要技術。該技術通過體外轉錄目的RNA的一部分或全長,用生物素標記轉錄產物,再與鏈霉親和素磁珠孵育使之固定在磁珠上,用以“pull down”互作蛋白,純化的產物蛋白經特定抗體的western-blot實驗,可驗證某種蛋白與目的RNA/DNA是否有相互作用;純化的蛋白經質譜鑒定,即可篩選到與目的RNA結合的蛋白。

CHIRP-MS是研究體內條件下RNA與蛋白互作的技術。該技術在特定時間點用甲醛交聯等方式固定細胞內RNA與蛋白及核酸的互作復合物,再利用生物素標記的探針及鏈霉親和素磁珠純化出與RNA結合的蛋白及核酸的復合物,分離產物中的蛋白質做質譜鑒定,即可篩選出與目的RNA結合的蛋白。



應用領域


用于目的RNA或DNA的互作蛋白驗證或篩選,如驗證或尋找特定基因的轉錄因子。


技術優點


這三種技術是捕獲RNA/DNA-蛋白復合體的最常用方法,結合western-blot實驗可以驗證某種蛋白是否與目的RNA/DNA互作,結合質譜技術可以高通量鑒定與RNA/DNA結合的目的蛋白。



技術流程


RNA體外轉錄→ 與細胞/細胞核裂解液孵育→ 純化互作蛋白→ 洗滌、洗脫互作蛋白→ western-blot或質譜鑒定。
輝駿生物:核酸蛋白互作流程圖



參考文獻


1.Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods MolBiol 1480:99-113(2016).
       
2.The long noncoding RNA ASNR regulates degradation of Bcl-2 mRNA through its interaction with AUF1. Sci Rep 6:32189(2016).
       
3.Silencing of the mRNA-binding protein HuR increases the sensitivity of colorectal cancer cells to ionizing radiation through upregulation of caspase-2. Cancer Lett 393:103-112 (2017).
       
4.Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions. Mol Cell 44(4):667-678(2011).
       
5.Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell 161(2):404-416(2015).

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