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串聯親和純化(TAP-MS)

實驗目的


尋找靶蛋白的互作蛋白

 

服務簡介


TAP/MS是Co-IP/MS的“近親”,兩者在尋找誘餌蛋白的互作蛋白以及純化互作蛋白的原理類似。不同的是TAP/MS引入了2個純化標簽(strep或SBP,flag),2步純化,能有效純化裂解液中的靶蛋白及其復合物,并使非特異性蛋白的數量降至較低水平。實驗組和對照組洗脫的蛋白分別做質譜,從實驗組結果中扣除對照組中的蛋白,即可鑒定出與靶蛋白互作的蛋白。


技術優勢


1、TAP/MS鑒定到的互作蛋白是細胞內與誘餌蛋白天然互作的,符合體內真實生理情況,可信度高。

2、采用兩步純化,能有效減少非特異蛋白的結合。


服務內容


1、構建Flag-strep(或Flag-SBP)雙標簽的靶基因表達載體;
 
2、包裝慢病毒感染目的細胞,做成過表達細胞株,WB檢測表達效果(基因大于2kb時,可能導致病毒滴度不足以感染細胞系,此時如需進行加藥篩選構建穩轉細胞系,則周期預計延長3-4周);
 
3、細胞總蛋白,經streptactin 樹脂(或strep磁珠)和anti-flag抗體兩步純化,并洗脫;
 
4、實驗組和對照組的洗脫液分別用胰酶酶解;
 
5、LC-MS/MS分析,獲得蛋白質的定量、定性信息;
 
6、實驗組結果扣除對照組中的蛋白,即可得到與靶蛋白互作的蛋白。

串聯親和純化(TAP-MS)
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