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SILAC應用之蛋白質相互作用(SILAC-IP)

SILAC研究蛋白質相互作用概述


SILAC (Stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC) 結合免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP) ,來尋找互作蛋白,是SILAC在定量蛋白質組學研究基礎上的進一步應用;舅悸肥峭ㄟ^質譜鑒定及分析蛋白的相對表達量來判斷某一蛋白是否與誘餌蛋白特異結合,當實驗組與對照組中某個蛋白質含量達到統計學差異時,即可判定該蛋白質與誘餌蛋白質存在互作。


 

與傳統的免疫共沉淀(CoIP)或pull down相比,SILAC-IP有以下優勢


1、特異性強,假陽性極低;     
  
2、高通量,液相與質譜連用,能最大限度的尋找到相互作用的蛋白質;    
  
3、靈敏度高;
 
4、能直接檢測出與bait蛋白互作的其它蛋白的相對含量。

 


SILAC研究蛋白質相互作用技術流程

實驗流程:



不同的實驗背景和目的需對應用不同的SILAC-IP實驗方案


方案一:以正常細胞株為實驗材料
  1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養細胞,培養至第5~6代時取等量細胞提取蛋白質;
  2. 提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做免疫沉淀(IP);
  3. 混合輕、重鏈IP產物,SDS-PAGE分離;
  4. 膠內酶切,肽段抽提、純化、鑒定和定量(圖1:成對出現的峰為非特異性結合蛋白)。

 
正常細胞株的SILAC-IP實驗設計
圖1 正常細胞株的SILAC-IP實驗設計



方案二:以過表達bait蛋白的細胞株為實驗材料
  1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養正常對照細胞和過表達bait蛋白的細胞株(帶標簽),培養至第5~6代時取等量細胞混合并提取蛋白質;
  2. 提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白均用標簽蛋白抗體做IP;
  3. 混合輕、重鏈IP產物,SDS-PAGE分離;
  4. 膠內酶切,肽段抽提、純化,質譜鑒定和定量(圖2:成對出現的峰強一致的峰為非特異性結合蛋白)。

 
過表達細胞株的SILAC-IP實驗設計
圖2 過表達細胞株的SILAC-IP實驗設計

 

方案三:以RNAi bait基因的細胞株為實驗材料
  1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養RNAi bait基因的細胞株和正常對照細胞株,培養至第5~6代時取等量細胞混合并提取蛋白質;
  2. 提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白均用抗bait蛋白的特異抗體做IP;
  3. 混合輕、重鏈IP產物,SDS-PAGE分離;
  4. 膠內酶切,肽段抽提、純化,質譜鑒定和定量(圖3:成對出現且峰強一致的為非特異性結合蛋白;由于RNAi組的細胞株內bait蛋白含量下降,因而與其相互作用的蛋白的豐度也相對較低,表現為峰強的減弱)。
RNAi細胞株的SILAC-IP實驗設計
圖3 RNAi細胞株的SILAC-IP實驗設計




SILAC研究蛋白質相互作用結果組成

                   圖4:SILAC分析蛋白質相互作用的質譜峰圖及被鑒定蛋白的生物信息分析

 

SILAC研究蛋白質相互作用技術服務內容


1、細胞同位素標記;(本公司出售L、M、H型Lys和Arg)

2、樣本制備與定量;

3、SDS-PAGE分離、酶切、LC-MS/MS分析;

4、蛋白定性及定量分析;

5、互作蛋白的生物信息學分析

6、實驗報告整理。


 

SILAC適用范圍


SILAC能標記活的可傳代細胞、細菌等材料,不能標記組織、體液等樣本,詳情請咨詢我司。



實驗服務報告內容


1、蛋白質鑒定;

2、SILAC鑒定相互作用蛋白質的分析結果;
  
3、顧客指定蛋白質對應的質譜峰圖;  
  
4、完整的技術服務報告,包括實驗步驟、使用試劑、儀器、軟件檢索參數等。


 

實驗服務周期及收費標準 


咨詢本公司QQ/電話:400 699 1663

 

質量承諾


1、根據您的實驗目的為您設計科學合理的SILAC實驗方案;

2、提供客觀、真實的實驗結果。

 

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